Nautre：全基因组筛选构建mTORC1调控网络及T细胞免疫的营养调控信号枢纽

T细胞是适应性免疫主要执行者之一，在抵抗病原体和肿瘤中有重要作用。T细胞的激活需要T细胞受体(TCRs)、共刺激和细胞因子等传统的免疫信号。最近有研究报道，营养物质也可以调节T细胞免疫反应，mTORC1激活可能是其中的机制之一。但是，营养物质转运体和传感器的调控机制在很大程度上仍不明确。目前，也缺乏关于mTORC1的系统整合的的调节网络研究。

最新研究

2021年11月18日，圣朱迪儿童医院的Hongbo Chi（迟洪波）团队在Nature 上发表了题为《CRISPR screens unveil signal hubs for nutrient licensing of T cell immunity》的文章。文章使用全基因组CRISPR筛选获得了346个mTORC1调控因子，结合蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建了mTORC1信号调控网络、识别调节模块。作者对其中3个新发现的mTORC1调控模块SWI/SNF复合体、SEC31A和CCDC101进行了功能验证，发现（1）SWI/SNF复合物通过抑制氨基酸传感器CASTOR1的表达增强mTORC1的激活；（2）SEC31A通过与GATOR2的亚基SEC13相互作用，保护SEC13免受SKP1依赖的蛋白酶体降解，促进mTORC1激活，SEC31A缺失会损害Treg抑制功能；（3）CCDC101相关的SAGA复合物是mTORC1的负性调控因子，CCDC101可以抑制葡萄糖和氨基酸转运体的表达，抑制Treg细胞功能，小鼠的Treg细胞中CCDC101缺失将导致炎症失控和抗肿瘤免疫增强。总之，该研究基于CRISPR筛选和实验验证揭示了营养物质转运体、营养物质感受器和营养信号转换器与免疫信号相互作用，共同调节mTORC1信号的分子机制，并揭示了它们在T细胞免疫功能调控中的作用。

CRISPR筛选和PPI功能模块分析发现多个新的mTOCR1调控模块

作者以核糖体蛋白S6磷酸化水平为mTORC1激活的标志，发现Treg细胞对TCR信号和营养信号的响应模式差异最大，所以作者用Treg极化因子处理T细胞，在营养剥夺的情况下结合两个不同浓度的CD3抗体建立系统来进行全基因组CRISPR筛选。

作者发现了292个mTORC1正性调控因子和125个mTORC1负性调控因子，其中有已知的mTORC1正性调控因子GATOR2 (SEC13、MIOS、SEH1L、WDR24和WDR59)和负性调控因子TSC1/2、GATOR1 (NPRL2、NPRL3和DEPDC5)。为了提高结果的可靠性，作者对这417个基因进行第二次CRISPR筛选，其中83%的候选基因(286个正性和60个负性)与第一次筛选结果一致。KEGG分析发现，这346个基因在多种mTORC1相关信号通路中富集。

为了解析346个基因在mTORC1信号网络中的调控关系，作者将它们整合到PPI数据库进行了功能模块分析，发现了多个mTORC1调控模块。本文重点研究了SWI/SNF复合体、SEC31A和CDC101。

SWI/SNF复合体通过抑制Castor1进而激活mTORC1

有研究发现SWI/SNF在Treg细胞中调控FOXP3的表达，但是其在mTORC1信号调控中的作用未见报道。实验验证发现，敲除SWI/SNF复合体的亚基SMARCB1、SMARCA4、ARID1A或DPF2均能显著抑制mTORC1信号的激活；在Smarcb1敲除细胞中，氨基酸诱导的mTORC1信号激活受到抑制。这表明SMARCB1参与氨基酸激活mTORC1的过程。

转录组分析发现，刺激TCR 20h后，和野生型细胞相比，Smarcb1敲除细胞中mTORC1中的Castor1显著上调。Castor1是细胞质内的精氨酸传感器，有研究发现靶向降解Castor1能激活mTORC1。作者发现，在野生型Treg细胞中，敲除Castor1不影响S6磷酸化水平，过表达Castor1抑制S6磷酸化水平；在Smarcb1敲除细胞中，敲除Castor1显著上调了S6磷酸化水平。这些结果表明Treg细胞中，SWI/SNF复合体通过抑制Castor1进而激活mTORC1。

SEC31A介导GATOR2依赖的mTORC1激活

在PPI功能模块中，作者还发现了一个由SEC31A和GATOR1/2和组成的功能模块，SEC31A是外被蛋白复合物II (COPII)的亚基，促进内质网(ER)运输囊泡的形成，但是其对mTORC1的调控鲜见报道。免疫共沉淀发现SEC31A与GATOR2 中的SEC13亚基存在相互作用。SEC31A敲除显著阻断了营养（氨基酸、葡萄糖）和TCR诱导的mTORC1激活。免疫荧光染色显示，SEC31A缺失阻断了细胞对氨基酸刺激的响应。在Treg移植的免疫缺陷小鼠模型中，和野生型细胞相比，SEC31A敲除的Treg细胞的增殖能力受损，抑制T细胞累积能力减弱；用LCMV感染小鼠后，抗原特异性T细胞反应也减弱了。这些结果表明，SEC31A参与营养信号和免疫信号诱导的mTORC1激活。

作者还发现在SEC31A敲除细胞中SEC13蛋白水平下调，在SEC31A敲除细胞中过表达SEC13完全恢复了mTORC1活性，在野生型细胞中过表达SEC13则不上调mTORC1活性。这些结果提示，SEC31A可能通过SEC13影响GATOR2功能进而调控mTORC1的活性。

SEC31A保护SEC13不受降解

SEC31A是如何调控SEC13的？作者发现在SEC31A敲除细胞中，SEC13的mRNA水平略有上调，蛋白半衰期缩短了一半，蛋白酶体抑制剂MG132能恢复SEC13的蛋白水平，这表明SEC31A通过转录后调控影响了SEC13的蛋白水平。敲除SEC31A后，SEC13泛素化水平升高，这提示SEC31A通过去泛素化抑制了SEC13的降解。作者测试了不同的泛素化修饰位点突变的SEC13，发现SEC13 K260R突变体稳定性最强，在长时间TCR刺激后，野生型SEC13泛素化修饰上调，而SEC13 K260R突变体泛素化水平无变化。这表明，SEC13A可能通过某种机制影响了SEC13 K260位点的泛素化水平。

为了确定SEC13A泛素化修饰的机制，作者通过定量相互作用蛋白质组学寻找SEC13的泛素化修饰酶，发现SCF E3连接酶SKP1是和SEC13相互作用最强的蛋白之一。免疫共沉淀显示，敲除SEC31A后，SEC13与SKP1相互作用增强。用CD3和CD28抗体刺激T细胞72h，SKP1和SEC13的内源性相互作用增强，SEC13泛素化水平上调。这表明，SEC31A通过抑制SKP1与SEC13的相互作用促进了SEC13的稳定性。

此外，作者发现，单独敲除SKP1上调了SEC13的蛋白水平，但没有上调GATOR2其他亚基的蛋白水平，也没有上调mTORC1的活性；SKP1和SEC31A双敲除可以恢复SEC31A敲除引起SEC13的蛋白水平降低和mTORC1活性降低；用LCMV感染SKP1和SEC13A双敲除的T细胞移植的免疫缺陷小鼠中，发现SKP1敲除能恢复SEC13A敲除引起的细胞功能抑制。这表明，SEC31A保护SEC13免受SKP1依赖的蛋白酶体降解，从而促进mTORC1激活和体内T细胞启动。

CCDC101是mTORC1的重要负性调控因子

作者还深入研究了筛选发现的mTORC1信号抑制因子CCDC101。CCDC101是染色质修饰的SAGA复合体的组成成分。作者发现，和野生型细胞相比，CCDC101敲除能上调营养信号和TCR信号诱导的mTORC1信号。这表明SAGA复合体具有抑制mTORC1激活的作用。转录组分析显示，CCDC101敲除细胞中葡萄糖转运体(Slc2a1，编码GLUT1)和氨基酸转运体(Slc16a10和Slc43a1)的表达显著上调。作者在CCDC101敲除细胞中敲除Slc2a1、Slc43a1或Slc16a10，发现双敲除可以部分阻断了pS6水平的上调。这提示CCDC1可能通过抑制营养转运体抑制mTORC1信号。此外，敲除Rraga(编码RAGA)或SEC13可以显著抑制CCDC101敲除引起的mTORC1激活，这表明CCDC101可以通过GATOR2和RAGA信号通路来抑制mTORC1活性。此外，分析特异性敲除CD4 T细胞中CCDC101基因的小鼠发现特异性敲除CCDC101的T细胞活性比野生型的pS6水平更高，特异性敲除CCDC101的Treg细胞FOXP3表达减少，mTORC1活性增加。这些结果表明CCDC101是mTORC1的一个重要的负调控因子。

CCDC101参与T细胞稳态和抗肿瘤免疫调控

为了确定CCDC101 在Treg细胞中的功能，作者构建了Treg细胞特异性敲除CCDC101的小鼠模型。和野生型小鼠相比，特异性敲除小鼠中IL2 +和IFNγ+效应性记忆T细胞增加，特异性敲除的老年小鼠中出现全身炎症性疾病。这提示CCDC101可能和免疫稳态改变、自发性炎症相关。

Treg细胞在抗肿瘤免疫发挥重要作用。作者发现，在MC38荷瘤实验中，特异性敲除小鼠的肿瘤生长显著受到强烈抑制，这表明CCDC101敲除Treg细胞的免疫抑制功能可能受损。为了解析CCDC101敲除对肿瘤微环境的影响，作者对荷瘤小鼠肿瘤中的CD45+细胞进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq) 和流式分析，结果均显示特异性敲除小鼠中总CD8+ T细胞比例增加，效应性CD8+ T细胞比例增加。

此外，scRNA-seq和流式细胞术分析显示，特异性缺陷小鼠的肿瘤中Treg细胞百分比减少，FOXP3表达水平降低，Treg抑制型标记物Icos、Tnfrsf18和Ctla4的表达减少，IFNγ表达增多，此外，在肿瘤内CCDC101缺陷Treg细胞中，Treg细胞百分比和FOXP3表达受到抑制。这表明CCDC101在维持肿瘤中Treg细胞稳态和功能抑制方面具有关键作用。

总   结

免疫细胞的功能和行为变化往往需要免疫细信号和营养信号的共同作用。mTORC1是免疫信号和营养信号的重要整合器。本文中，作者系统地构建了T细胞mTORC1信号调控网络，并揭示了营养信号激活mTORC1、调控适应性免疫的机制，深入探索了3个新的T细胞免疫过程中的营养调控信号，发现：（1）SWI/SNF复合体通过抑制氨基酸传感器CASTOR1，正向调控mTORC1；（2）SEC31A与GATOR2的亚基SEC13相互作用增强其稳定性，正向调控mTORC1，SEC31A缺失会损害Treg抑制功能；（3）CCDC101通过抑制葡萄糖和氨基酸转运体的表达，负向调控mTORC1，破坏Treg细胞抑制功能。本研究为理解免疫相关疾病的提供了重要信息。

文/ 阿司匹林 SHTN

责编/Jane

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-021-04109-7

点个分享，把好知识传播出去！